title: Henri Diamant-Berger

text: A través de su conexión con Barrymore, Diamant-Berger adquirió los derechos para el cine de una obra producida en Broadway en 1921 escrita por la exesposa de John Barrymore, Blanche Oelrichs. Su versión cinematográfica francesa llevó por título "Clair de lune" (1932), y fue protagonizada por Claude Dauphin y Blanche Montel. Entre sus películas sonoras más notables figura un remake de "Les Trois Mousquetaires" (1933), una epopeya de seis horas de duración para la que escribió la adaptación a la pantalla y en la que se utilizó a la mayor parte del mismo elenco de la versión muda de 1921. Otros esfuerzos como director suyos incluyen dos películas detectivescas sobre Arsenio Lupin en 1937. Sin embargo, después de dirigir "Tourbillon de París" en 1939, tuvo que mantenerse alejado durante ocho años de la actividad cinematográfica debido a la Segunda Guerra Mundial. En 1951 dirigió el aclamado drama "Monsieur Fabre", protagonizado por Pierre Fresnay.


title: Henri Diamant-Berger

text: Durante la década de los sesenta se dedicó exclusivamente a producir una serie de películas que funcionaron muy bien en taquilla, con títulos como "La Belle Américaine" (1961), "Un drôle de Paroissien" (1963) y "Allez France!" (1966).


title: Henri Diamant-Berger

text: Henri Diamant-Berger murió a los 76 años en París.


title: Satelight

text: El estudio fue fundado en diciembre de 1995, en Sapporo, Hokkaido, siendo su primer proyecto "Bit the Cupid", la primera serie de televisión totalmente animada digitalmente en el mundo. El nombre "Satelight" consiste en 'S' de 'Sapporo', 'A' para 'animación', 'T' para la 'tecnología y 'E' para 'entretenimiento'. El presidente de la compañía es Michiaki Satō, además; el conocido director y creador de anime Shōji Kawamori es un director ejecutivo en la compañía.


title: Satelight

text: En 1996, el próximo proyecto del estudio estaba produciendo la animación CG por el Group TAC, Īhatōbu Genso: Kenji no Haru. Pronto se estableció un estudio de producción en 1998 en Suginami, Tokio. El estudio pronto produjo su primera serie de televisión, Earth Girl Arjuna de Shoji Kawamori en 2001. En 2006, el estudio cambió su sede de Sapporo a Tokio.(2017, serie de televisión)


title: Arabi

text: Arabi puede referirse a:


title: Sube, Pelayo, sube

text: Sube, Pelayo, sube fue un programa de televisión mexicano emitido originalmente por la cadena privada local Telesistema Mexicano y producido a inicios de la década de los 70s.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Consistía de una emisión de concursos muy ingeniosos que retaban la habilidad y destreza de los participantes. Regalaba más de 14 mil pesos de su época y hasta una casa, siempre y cuando los concursantes resultaran vencedores en la competencia.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Mucha gente pensaba, que ir a competir a esta emisión, era la solución a sus problemas económicos.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Debido al gran éxito que logró, el conductor decidió sacar el programa del estudio para llevarlo a distintas ciudades de la República Mexicana y presentarlo en parques, estadios y plazas de toros.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Los concursos eran: "Pa' arriba papi, pa' arriba", "La llave del tesoro", "Los costales", "El palo ensebado" y la competencia de canto. En dicha emisión, a Pelayo lo acompañaba "El Juez" que era Leandro Espinosa y "La profesora Paty". Una vez que concluyó sus transmisiones, Luis Manuel Pelayo se dedicó más a la locución, al doblaje y a la actuación.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Luis Manuel Pelayo se inmortalizó al hacer la voz de "Kalimán, El Hombre increíble", en la radionovela de este personaje; en el cine filmó más de 70 películas, algunas de ellas al lado del inolvidable Pedro Infante y del galán de moda, Mauricio Garcés; dentro del doblaje puso su voz a varios personajes de las cintas de Disney, series americanas de televisión, de las de los dibujos animados, y además, participó en más de una docena de novelas.


title: Sube, Pelayo, sube

text: Fue el conductor y animador del programa de concursos en el que todos los televidentes soñaban con participar: "Sube Pelayo, Sube".


title: Sube, Pelayo, sube

text: Este polifacético histrión murió el 26 de julio de 1989.


title: Distrito electoral federal 4 de Sonora

text: El IV Distrito Electoral Federal de Sonora es uno de los 300 distritos electorales en los que se encuentra dividido el territorio de México y uno de los 7 en los que se divide el estado de Sonora. Su cabecera es la ciudad de Guaymas.


title: Distrito electoral federal 4 de Sonora

text: El Cuarto Distrito de Sonora esta formando por los 39 municipios de Aconchi, Bacerac, Bavispe, Banamichi, Huépac, San Felipe de Jesús, Nacozari de García, Cumpas, Opodepe, Carbó, Rayón, San Miguel de Horcacitas, Baviácora, Ures, Moctezuma, Villa Hidalgo, Huachinera, Huásabas, Bacadehuachi, Granados, Divisadero, Nácori Chico, Tepache, San Pedro de la Cueva, Villa Pesqueira, Mazatán, Sahuaripa, Arivechi, Bacanora, Soyopa, San Javier, La Colorada, Suaqui Grande, Ónavas, Yécora, Empalme, Bácum, San Ignacio Río Muerto y Guaymas. Siendo esta última la cabecera distrital según la distritación de 2005.


title: Distrito electoral federal 4 de Sonora

text: El distrito estuvo conformado por los municipios de Aconchi, Arivechi, Bacadehuachi, Bacanora, Bacerac, Bácum, Banamichi, Baviácora, Bavispe, Carbó, Cumpas, Divisaderos, Empalme, Granados, Guaymas, Huachineras, Huásabas, Huépac, La Colorada, Mazatán, Moctezuma, Nácori Chico, Nacozari de García, Ónavas, Opodepe, Rayón, Sahuaripa, San Felípe de Jesús, San Ignacio Río Muerto, San Javier, San Miguel de Horcasitas, San Pedro de la Cueva, Soyopa, Suaqui Grande, Tepache, Ures, Villa Hidalgo, Villa Pesquera y Yécora.


title: Barataria

text: Barataria puede referirse a:


title: Bastrop

text: Bastrop puede referirse puede hacer referencia a varios lugares de Estados Unidos:


title: Kepler-76b

text: Kepler-76b es un planetas extrasolares que orbita la estrella Kepler-76, el único detectado hasta la fecha en esta estrella. Fue descubierto por el método de tránsito astronómico en el año 2013.


title: Kepler-76b

text: Este planeta fue descubierto en una curva de luz del Kepler utilizando el algoritmo BEER (efecto radiante de elipsoidal y modulaciones de reflexión en inglés). Las observaciones de seguimiento utilizando espectros de TRES y SOPHIE confirmaron la naturaleza planetaria del objeto. El planeta tiene el apodo de "El planeta de Einstein", ya que el método de confirmación hace uso de la relatividad especial.


title: Lydia Alfonsi

text: Lydia Alfonsi o, acorde al anagrafe Lidia Alfonsi, (n. Parma el 28 de abril de 1928) es una actriz de teatro, televisión y de cine italiana.


title: Lydia Alfonsi

text: Lidia Alfonsi nació en Parma en una familia de clase media acomodada; a edad temprana, la joven Alfonsi interrumpió sus estudios de contabilidad para seguir una carrera en el teatro. En 1946 ganó un concurso nacional de teatro de aficionados y fue observada por uno de los miembros del jurado, el director Anton Giulio Bragaglia, que inmediatamente la contrató para su compañía. Muy pronto fue elegida en papeles principales en obras de teatro y, a menudo en obras clásicas, incluyendo muchas de las tragedias griegas. En 1957 hizo su debut en el cine y luego en 1960 comenzó una relación profesional y sentimental (duró hasta su muerte en un accidente de coche en 1963) con el director de la televisión Giacomo Vaccari, protagonizando varios programas dramáticos en la RAI TV exitosamente dirigida por Vaccari. Desde mediados de la década de 1970 Lydia Alfonsi se semiretiró, haciendo apariciones esporádicas sólo en 1988 (con la película de televisión "Una lepre con la faccia da bambina" / Una liebre con la cara de niña), en 1990 (en el filme de Gianni Amelio" "Open Doors") y en 1997 (en el filme de Roberto Benigni llamado "La vida es bella"). Desde mediados de 1970 Alfonsi está semiretirada, haciendo apariciones esporádicas sólo en 1988 (con la película de la TV "Una lepre la de la estafa faccia da bambina"), en 1990 (en "Puertas abiertas" de Gianni Amelio) y en 1997 ("La vida es bella", de Roberto Benigni).


title: Lydia Alfonsi

text: Alfonsi fue nombrada Gran Oficial de la República Italiana.


title: Tidal (servicio)

text: Tidal (estilizado como TIDAL) es un servicio de música de emisión continua basado en suscripción que combina audio sin pérdida y videos musicales de alta definición con una editorial selecta. El servicio no ofrece un plan gratuito actualmente, y afirma pagar el porcentaje más alto de las regalías a los artistas de la música y compositores dentro del mercado de música de emisión continua.


title: Tidal (servicio)

text: Tidal fue lanzada en 2014 por la compañía noruega Aspiro. Tiene contratos de distribución con las tres mayores compañías discográficas, además de varias compañías independientes. En el primer trimestre de 2015, Aspiro fue adquirida por Project Panther Ltd., propiedad de Shawn «Jay Z» Carter.


title: Tidal (servicio)

text: Seguido de la adquisición de Aspiro por Jay Z en marzo de 2015, una campaña masiva fue introducida para relanzar Tidal. Varios artistas musicales cambiaron sus fotos de perfil por azul, y postearon «#TIDALforAll» en Facebook, Twitter e Instagram. Una conferencia de prensa tuvo lugar el 30 de marzo de 2015 para presentar a dieciséis artistas en el escenario, incluido Jay Z, quienes fueron los copropietarios y accionistas en Tidal. El servicio fue promocionado como el primer servicio de emisión continua controlado por artistas. Cada artista firmó públicamente una declaración que abrió con un mensaje: «A lo largo de la historia, cada movimiento comenzó con unas pocas personas unidas por una visión en común, una visión para cambiar el statu quo». El relanzamiento de Tidal con el nuevo modelo de propiedad del artista recibió críticas mixtas de publicaciones y amigos músicos. Algunos elogiaron la impresionante calidad de sonido, sin pérdida de audio, y el alto precio de suscripción que podría resultar en altas regalías para los artistas y compositores, mientras otros sintieron que el contenido exclusivo de Tidal podría incrementar la piratería.


title: Tidal (servicio)

text: A julio de 2016, el servicio tenía más de 4.2 millones de usuarios de paga después de haberse integrado con su servicio hermano, WiMP, así como más de 17 000 usuarios usando el servicio de alta fidelidad.


title: Tidal (servicio)

text: El 15 de mayo de 2018 para hacer frente a la hegemonía de Spotify en el mercado español, ofreciendo servicios Premium gratis a los clientes que desean activar con sus cuentas con las tarifas de Vodafone.


title: Tidal (servicio)

text: El 4 de marzo de 2020 se anunció que Square, Inc. adquirirá la mayoría de las acciones de TIDAL por un valor de 297 millones de dólares la cual se espera pagar una mezcla entre efectivo y acciones, se espera que el miembro del consejo de TIDAL y accionista Shawn "JAY-Z" Carter se una al Consejo de Administración de Square sujeto al cierre de la transacción. Además de JAY-Z, todos los accionistas artistas de TIDAL seguirán siendo copropietarios de TIDAL después de que se cierre el acuerdo.


title: Tidal (servicio)

text: Actualmente, Tidal informa que opera en 56 países y cuenta con más de 70 millones de canciones y más de 250 mil videos de alta calidad en su catálogo.


title: Tidal (servicio)

text: Originalmente Aspiro lanzó la marca Tidal en el Reino Unido, Estados Unidos y Canadá el 28 de octubre de 2014. El lanzamiento fue apoyado por Sonos y otras 15 fabricantes de audio en casa como socios integrados. En enero de 2015, Tidal se lanzó en cinco países europeos más: Irlanda, Finlandia, Países Bajos, Bélgica y Luxemburgo.


title: Tidal (servicio)

text: Aspiro fue comprada por Project Panther Ltd., propiedad de Shawn «Jay Z» Carter, por 466 millones de coronas suecas, que equivale a 56.2 millones de dólares en enero de 2015. Antes de adquirir Aspiro, Jay Z declaró en una entrevista con Billboard que está buscando asociarse con otro servicio de música para impulsar su visión: «Hablamos con cada servicio y hemos explorado todas las opciones. Pero al final del día, caímos en la cuenta que si daremos forma a esto de la manera que lo vemos, entonces tenemos que ser independientes. Y eso se convirtió en una mejor propuesta para nosotros, no en la más fácil.»


title: Tidal (servicio)

text: Actualmente Tidal es propiedad de Jay Z, y una variedad de otros artistas musicales de diferentes géneros musicales dentro del campo. el primer servicio de emisión continua controlado por artistas en el mundo. El lema «Cambia el rumbo» y «#TIDALforAll» fue usado por varios artistas en las redes sociales durante el progreso de la conferencia de prensa que relanzó el servicio. La idea de una plataforma de emisión continua controlada por artistas fue declarada como para «restaurar el valor a la música lanzando un servicio dirigido por artistas». Durante la susodicha conferencia, Jay Z mismo, Beyoncé, Rihanna, Kanye West, Jack White, Arcade Fire, Usher, Nicki Minaj, Chris Martin, Alicia Keys, Calvin Harris, Daft Punk, deadmau5, Jason Aldean, J. Cole y Madonna fueron presentados en el escenario como los «propietarios de TIDAL». Drake también es propietario parcial de la compañía. Eric Harvey de Pitchfork Media indicó que los artistas mencionados representan «el 1 % de la música pop en el mundo ahora, esos son artistas que no responden a los sellos discográficos, que no responden a corporaciones».


title: Tidal (servicio)

text: Un punto de venta clase para Tidal como represalia para competir con otros servicios de la misma categoría, como Spotify y Pandora Radio, es el contenido exclusivo disponible y se espera para el futuro de los artistas actuales que controlan la empresa, así como los demás. El contenido exclusivo en el relanzamiento incluyen el sencillo «Bitch Better Have My Money» de Rihanna; la primera aparición en televisión de The White Stripes, "Daft Punk's Electroma" (2006); listas de reproducción personalmente diseñados por Jay Z, Beyoncé, Arcade Fire y Coldplay, y un previo del nuevo proyecto colaborativo de Todd Rundgren con Anders Lindström y Emil Nikolaisen, el videoclip para el sencillo Feeling Myself de Nicki Minaj junto con Beyoncé, y más. Tidal dijo en su página oficial de Twitter que una «gran cantidad de material exclusiva está en camino».


title: Tidal (servicio)

text: El 30 de marzo de 2015, una conferencia de prensa tomó lugar en la Estación Moynihan en Ciudad de Nueva York para relanzar Tidal oficialmente. La conferencia inició con una breve introducción y explicación de Tidal por Vania Schlogel de Tidal. Después de presentar a los dieciséis artistas, Alicia Keys tomó la palabra para representar a los artistas y Tidal. Ella dijo: «Así que nos reunimos antes de este día, 30 de marzo de 2015, con una voz unánime con la esperanza de que hoy será otro de esos momentos en el tiempo, un momento que cambiará para siempre el curso de la historia de la música.» Keys describió el evento como una «graduación». Al final de la conferencia de prensa, todos los artistas en el escenario firmaron una declaración, que indica la misión de Tidal e información sobre la compañía.


title: Tidal (servicio)

text: Seguido de la conferencia de prensa, el publicó quedó confundido al percibir que mucha información no fue expuesta, tales como el monto de las regalías que compensará a los artistas y compositores comparado a los competidores como Spotify, y si Tidal proporcionará otras características detrás de la música y videos. Tidal afirmó que ganó 100 000 nuevos suscriptores después de la conferencia de prensa.


title: Tidal (servicio)

text: Glenn Peoples de "Billboard" escribió que Tidal fue una buena idea para la industria musical. Dijo que el mercado de emisión continua estadounidense necesita una «patada en el trasero» cuando se miró la tasa de crecimiento de "streaming" desde 2014 a 2015. Peoples notó que si hay más competición en el mercado podría generar gran «difusión de innovación». Concluyó diciendo que con un servicio como Tidal que está promocionada al pagar un monto justo de regalías a los artistas y compositores condunciría a la industria pondría en discusión el problema de las regalías por "streaming".


title: Tidal (servicio)

text: Desde el inicio del relanzamiento de Tidal, la crítica y escepticismo vino de música y publicaciones. Micah Peters, escribiendo en el sito web de USA Today, lanzó una lista titulada «3 razones de porqué el nuevo servicio de Jay Z es estúpido». El artículo se centra en los puntos que el modelo de audio sin pérdida de alta fidelidad está «sobreestimando al oyente promedio». Peters se preocupa que la mayoría de los oyentes no tienen los audífonos avanzados y requeridos para distinguir la diferencia entre un audio ordinario y de alta fidelidad. El artículo también afirma que el precio de 20 dólares no ha sido simplemente, a cierta razón, para el mercado masivo. La cantante Lily Allen expresó sus opiniones sobre Tidal en su cuenta de Twitter. Ella teme que el alto precio para acceder a Tidal, así como la popularidad masiva de los artistas copropietarios, podría paralizar la industria musical e incrementar la piratería. Ella afirmó: «Amo mucho a Jay-Z, pero Tidal es (demasiado) caro comparado a otros buenos servicios streaming. Él ha tomado a los artistas más grandes. Haciéndolos exclusivos para Tidal (¿estoy en lo cierto al pensar eso?), la gente volverá a pulular de nuevo en sitios piratas».


title: Tidal (servicio)

text: Como parte de un evento musical para recaudación de caridad para ayudar a los niños afectados por el huracán Katrina TIDAL transmitió este evento en directo en su sitio web, pero al momento del evento donde el cantante canadiense Drake haría su actuación TIDAL detuvo la transmisión del evento y coloco un mensaje donde decía:


title: Tidal (servicio)

text: De igual forma a través de Twitter TIDAL difundió este mensaje.


title: Tidal (servicio)

text: Tras este evento el sitio de noticias de interés, Buzzfeed le pidió a los representantes de Drake una explicación. Al parecer su representante no había autorizado esta transmisión en vivo, pero esta decisión era completamente ajena al contrato que tenía con Apple Music.


title: Tidal (servicio)

text: Esto fue lo que contestaron los representantes del rapero:


title: Tidal (servicio)

text: Que en español dice:


title: Tidal (servicio)

text: Es incierto por qué TIDAL tiro la culpa a Apple, después de esto Future comentó:


title: Tidal (servicio)

text: Una suscripción mensual cuesta 9.99 dólares para el servicio prémium estándar, o 19.99 para el servicio de calidad sin pérdida de alta fidelidad («HiFi»). Tidal afirma pagar el porcentaje más alto de regalía de cualquier compañía de música por "streaming", con aproximadamente el 75% de las suscripciones de los precios de suscripción de membresía que se les da a los sellos discográficos de artistas individuales y distribución de compositores. Un artista dijo que las regalías por pista desde Aspiro/Tidal son tres veces más alto de las regalías pagadas por Spotify, pero quizás las regalías desciendan para proporcionar suficiente retorno de la inversión. Jay Z comentó en una entrevista a "Billboard" que los artistas serían pagados más por estar en reproducción continua que en Spotify: «¿Los artistas ganarán más dinero? ¿Incluso si eso significa menos beneficios para nuestra línea de fondo? Absolutamente. Eso es fácil para nosotros. Podemos hacerlo. Menos beneficios para nuestra línea de fondo, más dinero para el artista; fantástico. Vamos a hacer eso hoy». En la misma entrevista, él afirmó que el servicio estuvo para las personas que están más abajo de la cadena alimenticia. «Para alguien como yo, puedo ir de gira, pero ¿qué pasa con la gente que trabaja en el estudio, los creadores de contenido y no sólo a los artistas? Si no están siendo compensados adecuadamente, entonces creo que vamos a perder algunos escritores y productores y gente así que dependen de un comercio justo. Algunos probablemente tendrá que tomar otro trabajo, y creo que vamos a perder algunos grandes escritores en el proceso.»


title: Tidal (servicio)

text: El valor de la suscripción puede variar en cada país que se encuentre disponible, las dos suscripciones más usadas de TIDAL son:


title: Tom Shrapnel

text: Thomas Heydon "Tom" Shrapnel, es un director, escritor y productor inglés.


title: Tom Shrapnel

text: Es hijo del actor John Shrapnel y de Francesca Ann Bartley-Shrapnel, sus hermanos mayores son: el actor Lex Shrapnel y el escritor Joe Shrapnel.


title: Tom Shrapnel

text: Sus abuelos maternos son la actriz escocesa Deborah Kerr y el productor Anthony C. Bartley.


title: Tom Shrapnel

text: Sus abuelos paternos son el periodista y autor Norman Shrapnel y Mary Lillian Edwards-Myfanwy.


title: Tom Shrapnel

text: Su tío es el compositor Hugh Shrapnel.


title: Bayou Vista

text: Bayou Vista hace referencia a dos localidades en Estados Unidos:


title: El bergantín «Mercury» atacado por dos barcos turcos

text: El bergantín "Mercury" atacado por dos barcos turcos es una obra de Iván Aivazovski pintada al óleo sobre lienzo con unas dimensiones de 212 x 339 cm. Según firma está datado en 1892 y actualmente se conserva en la Galería Nacional de Arte Aivazovski en Feodosia, República de Crimea. Aivazovsky Pintó aproximadamente 6.000 obras de las que más de la mitad fueron marinas.


text: La obra representa, tal como describe el título, a tres barcos, dos turcos y el bergantín ruso "Mercury", en combate cerrado sobre una mar encrespada. Aivazovsky pintó gran cantidad de "marinas" que incluían barcos o botes de diferentes características y muy a menudo estos barcos los representaba dañados o naufragados, sin embargo son muy escasas las representaciones en las que plasmara un combate naval abierto, de ahí lo excepcional de esta obra.


text: La batalla representada fue parte de la Guerra ruso-turca de 1828-1829, guerra provocada a raíz de la lucha de los griegos por independizarse del Imperio Otomano. El sultán turco comenzó las hostilidades contra el zar debido a la participación del Imperio ruso en la Batalla de Navarino lo que provocó el cierre del Estrecho de Dardanelos para los barcos rusos además de la anulación de la Convención de Akkerman firmada en 1826.


text: El fue un barco de "20 cañones" construido en Sebastopol, botado el 7 de mayo de 1820 y diseñado para labores de patrulla en las costas del Cáucaso septentrional. Estaba construido con roble de Crimea, era de poco calado y equipado con remos. Su diseño era poco común comparado con otros bergantines de la misma época pues el poco calado reducía y limitaba considerablemente su velocidad y los remos también eran vistos como una desventaja. Fue desguazado el 9 de noviembre de 1857.


text: El "Mercury" participó durante su existencia en varios combates navales de importancia. Uno de los más notorios, el representado en el cuadro, ocurrió cuando el "Mercury" junto a otros dos bergantines se enfrentó a una escuadra de 14 navíos turcos que retornaban a las costas de Anatolia. En un primer momento la victoria turca parecía inapelable pero las tornas de la batalla cambiaron y el "Mercury" fue capaz de escapar tras un poderoso asalto final de los tres bergantines poniendo fin al conflicto.


text: Tras el enfrentamiento, uno de los marineros de un barco turco, realizó un elogioso comentario sobre la navegabilidad del "Mercury" y la pericia y valentía de su capitán:


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: El ácido 1,3-bisfosfoglicérico (cuyo anión se llama 1,3-bisfosfoglicerato o 1,3BPG) es una molécula orgánica de 3 carbonos presente en la mayoría (si no es que en todos) de los seres vivos. Existe principalmente como intermediario metabólico tanto en la glucólisis durante la respiración celular, como en el ciclo de Calvin durante la fotosíntesis. El 1,3BPG es un compuesto de transición entre el glicerato 3-fosfato y el gliceraldehído 3-fosfato durante al fijación/reducción de. El 1,3BPG es también precursor del 2,3-bisfosfoglicerato el cual a su vez es un intermediario metabólico de la vía glucolítica.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: El 1,3-bisfosfoglicerato es la base conjugada del ácido 1,3-bisfosfoglicérico. Se trata de una molécula derivada del glicerol que se encuentra fosforilada en los carbonos 1 y 3. Esta doble fosforilación le brinda al 1,3BPG importantes propiedades biológicas, tales como la capacidad de fosforilar ADP para producir ATP.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: Como se mencionaba anteriormente el 1,3BPG es un intermediario metabólico en la vía glucolítica. Se crea a partir de la oxidación exergónica del grupo aldehído presente en el gliceraldehído 3-fosfato. Como resultado de esta oxidación, se produce la conversión del aldehído en un ácido carboxílico, el cual conduce a la formación de un enlace acil-fosfato. Incidentalmente este es el único paso en la vía glucolítica en el que se produce la conversión de  en NADH. La reacción de formación del 1,3BPG requiere de la presencia de una enzima llamada gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: El enlace de alta energía del 1,3BPG es importante en la respiración celular ya que contribuye a la formación de ATP. La molécula de ATP creada en la siguiente reacción es la primera molécula de ATP producida durante la respiración:


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: 1,3-bisfosfoglicerato + ADP 3-fosfoglicerato + ATP


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: La transferencia de un fosfato inorgánico desde el grupo carboxilo en el 1,3BPG al ADP para formar ATP es reversible debido a la baja ΔG. Esto se debe a que es el resultado de la ruptura de un enlace acil-fosfato, mientras que otro similar es creado. Esta reacción no es naturalmente espontánea y requiere de la presencia de un catalizador. Este papel es desempeñado por la enzima fosfoglicerato quinasa. Durante la resacción la fosfoglicerato quinasa experimenta un cambio conformacional inducido por el sustrato, similar al que experimenta otra enzima metabólica, la hexoquinasa.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: Debido a que se forman dos moléculas de gliceraldehído 3-fosfato durante la glucólisis a partir de una única molécula de glucosa; se puede decir que el 1,3BPG es respondable de la formación de dos de las diez moléculas de ATP producidas durante la totalidad del proceso. La glucólisis también hace uso de dos moléculas de ATP en sus etapas iniciales como primer paso de compromiso irreversible. Por esta razón la glucólisis no es reversible y tiene una producción neta de 2 moléculas de ATP y dos de NADH. Las dos moléculas de NADH por si solas pueden producir aproximadamente 3 moléculas de ATP cada una.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: El 1,3BPG desempeña un papel muy similar en el ciclo de Calvin al rol que desempeña en la vía glucolítica. Por este motivo ambas reacciones se dice que son análogas. Sin embargo esta última reacción se encuentra efectivamente invertida. La única diferencia mayor entre las dos reacciones es que se utiliza NADPH como dador de electrones en el ciclo de Calvin, mientras que en la glucólisis se utiliza  como aceptor de electrones. En este ciclo de reacciones el 1,3BPG se origina a partir del 3-fosfoglicerato por la acción de enzimas específicas.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: Contrariamente a las reacciones similares de la vía glucolítica, el 1,3BPG en el ciclo de Calvin no produce ATP, sino que lo utiliza. Por este motivo este puede ser considerado un paso irreversible y decisivo en el ciclo. El resultado de esta sección del ciclo es un fosfato inorgánico que resulta removido del 1,3BPG, mientras que se añade un ion hidrógeno y dos electrones al compuesto.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: En completa inversión a la reacción de la vía glucolítica, la enzima fosfoglicerato quinasa cataliza la reducción del grupo carboxilo del 1,3BPG para formar un aldehído. Esta reacción también libera una molécula de fosfato inorgánico, el cual se utiliza subsecuentemente como fuente de energía para la donación de electrones que lleva a la conversión del NADPH a . Llevando a cabo esta última etapa de la reacción se encuentra la enzima gliceraldehído-fosfato deshidrogenasa.


title: Ácido 1,3-bisfosfoglicérico

text: Durante el metabolismo normal en humanos, aproximadamente el 20% del 1,3BPG producido no ingresa en la vía glucolítica. En lugar de esto ingresa en una ruta alternativa que involucra la reducción de ATP en los eritrocitos. En esta ruta alternativa, el 1,3BPG es transformado en una molécula similar llamada 2,3-bisfosfoglicerato (2,3BPG). El 2,3BPG es utilizado como un mecanismo para facilitar la liberación eficiente de oxígeno desde la hemoglobina. Los niveles de 2,3BPG aumentan en la sangre de los pacientes cuando los niveles de oxígeno son bajos, por lo que se considera que este es uno de los mecanismos de aclimatación. Los niveles bajos de oxígeno desencadenan un aumento en los niveles de 1,3BPG, los cuales a su vez causan un aumento en los niveles de 2,3BPG, el cual aumenta la eficiencia de la disociación del oxígeno desde la hemoglobina oxigenada.


title: José Enrique Reina Lizárraga

text: José Enrique Reina Lizárraga (San Luis Río Colorado, Sonora; 12 de agosto de 1969) Miembro del Partido Acción Nacional, en el 2012 al 2015 ocupó el cargo de diputado federal por el Distrito I del estado de Sonora, y fue dos veces Presidente Municipal de San Luis Río Colorado para los periodos 2000-2003 y 2015-2018.


title: José Enrique Reina Lizárraga

text: José Enrique Reina Lizárraga es Ingeniero Mecánico Electricista desde 1993. Dentro de su trayectoria política se encuentra ser miembro del PAN en Sonora desde 1998, así como Secretario del Comité Directivo Estatal del PAN en Sonora de 2003 a 2005 y Presidente del Comité Directivo Estatal Sonora de 2005 a 2009, todos por el Partido Acción Nacional.


title: José Enrique Reina Lizárraga

text: Además fue elegido síndico del PAN para el periodo 1994 a 1997 y también como Presidente Municipal de San Luis Río Colorado de 2000 a 2003.


title: José Enrique Reina Lizárraga

text: Enrique Reina Lizárraga también se desempeñó como diputado Local de Sonora para la LXI Legislatura (de 2009 a 2012) donde ocupó varios puestos en comisiones y fungió como coordinador del grupo parlamentario del PAN. También fue director de Obras y Servicios Públicos del Ayuntamiento de San Luis Río Colorado entre 1997 y 2000.Es un dictador qué lleva 6 años en la silla del poder en San Luis Rio Colorado.


title: Pablo Costanzo

text: Pablo Costanzo (n. , Chascomús, Provincia de Buenos Aires) es un piloto argentino de automovilismo de velocidad. Iniciado en el ambiente del kart, desarrolló su carrera deportiva a nivel zonal y nacional, debutando profesionalmente en el año 2008, al estrenarse en la categoría de monoplazas Fórmula Metropolitana, de la que se quedó con el subcampeonato del año 2010. Su paso por los monopostos serviría como escuela para su debut en categorías de turismos, teniendo su estreno en el año 2010 en la categoría TC Rioplatense, donde competiría al comando de un Dodge GTX. En el año 2011 ascendió a la divisional TC Mouras de la Asociación Corredores de Turismo Carretera, donde compitió hasta el año 2012, temporada en la que al comando de un Chevrolet Chevy ascendería a la divisional TC Pista, donde compite desde la temporada 2013.


title: Valquíria Ferreira Dutra

text: Valquíria Ferreira Dutra (1980) es una bióloga, botánica, taxónoma, curadora, etnobotánica, y profesora brasileña.


title: Valquíria Ferreira Dutra

text: En 2002, obtuvo una licenciatura en ciencias biológicas por la Universidad Federal de Ouro Preto (licenciatura en botánica y BSc); completa en 2005, la maestría en botánica, supervisada por la Dra. Flávia Cristina Pinto Garcia (1965), y defendiendo la tesis: "Levantamento de Leguminosae Adans. nos Campos Rupestres do Parque Estadual do Itacolomi, MG: florística, preferência por habitat, aspectos reprodutivos e distribuição geográfica" por la Universidad Federal de Viçosa. Y nuevamente por la Universidad Federal de Viçosa, el doctorado, en 2009, en botánica. Tanto maestría como doctorado, fueron financiados con una beca de la Coordinación de Capacitación de Personal de Nivel Superior, CAPES, Brasil.


title: Valquíria Ferreira Dutra

text: Tiene experiencia en botánica, con énfasis en taxonomía de fanerógamas, trabajando principalmente en la identificación de especies arbóreas. Se especializa en la familia Elaeocarpaceae, con énfasis en el género "Sloanea". Actualmente es profesora de la Universidad Federal de Viçosa, también, desde 2011 de la Universidad Federal de Espírito Santo.


title: Valquíria Ferreira Dutra

text: Entre 2010 y 2011, fue becaria de la Coordinación de Capacitación de Personal de Nivel Superior, CAPES, Brasil. Su programa fue la biología molecular, en la misma casa de altos estudios de Viçosa.


Valquíria Ferreira Dutra


title: Teofilacto de Constantinopla

text: Teofilacto Lecapeno (en griego: "Θεοφύλακτος Λακαπηνός", "Theophylaktos Lakapenos", 917 – 27 de febrero de 956) fue hijo del emperador bizantino Romano I y patriarca ecuménico de Constantinopla del 2 de febrero de 933, hasta su muerte en 956.


title: Teofilacto de Constantinopla

text: Teofilacto fue el hijo menor del emperador bizantino Romano I Lecapeno y su esposa Teodora. El emperador planeó que su hijo llegara a ser patriarca de Constantinopla desde la muerte de Nicolás I el Místico en 925, pero tuvieron que pasar dos pequeños patriarcados y un periodo de dos años sin nadie en el puesto antes de que pudiera considerarse que Teofilacto tenía la edad suficiente para hacerse responsable de las funciones del cargo. Por ese tiempo fue castrado para favorecer su carrera eclesiástica.


title: Teofilacto de Constantinopla

text: Para elevarlo al patriarcado, su padre había asegurado el apoyo del papa Juan XI. Fue el tercer patriarca de Constantinopla que era hijo de un emperador y el único que lo fue durante el reinado de su padre. Su patriarcado, de poco más de 23 años, fue inusualmente largo. Aparte del bastardo eunuco, Basilio Lecapeno, que fue nombrado "parakoimomenos", Teofilacto fue el único hijo de Romano que mantuvo una posición de prestigio después de que su familia perdiera el poder en 945.


title: Teofilacto de Constantinopla

text: Teofilacto apoyó las políticas de su padre y buscó el ecumenismo eclesiástico, manteniendo un estrecho contacto con los patriarcas griegos de Alejandría y Antioquía. Envió misioneros a los magiares tratando de apoyar los esfuerzos diplomáticos imperiales a finales de los años 940. Por la misma época, aconsejó a su sobrino, el emperador Pedro I de Bulgaria, sobre la herejía de los bogomilos. También introdujo algunos elementos teatrales a la liturgia bizantina, aunque no recibió apoyo de los clérigos conservadores que lo rodeaban.


title: Teofilacto de Constantinopla

text: Los críticos de Teofilacto lo describen como un hombre irreverente, interesado principalmente en sus enormes establos de caballos, que estaba listo para abandonar la Divina Liturgia en Santa Sofía para asistir al alumbramiento de una de sus yeguas favoritas. Irónicamente, Teofilacto murió tras caer de un caballo en 956.


title: Center Point

text: Center Point es el nombre de varios lugares de los Estados Unidos:


title: Campamento Glaciar Unión

text: El Campamento Glaciar Unión (en inglés: "Union Glacier Camp") es un aeródromo privado de la Antártida ocupado estacionalmente entre noviembre y enero. Se encuentra en el glaciar Unión cerca de la cordillera Heritage en las montañas Ellsworth.


title: Campamento Glaciar Unión

text: El campamento es operado por la empresa privada estadounidense basada en Salt Lake City Antarctic Logistics & Expeditions LLC (ALE) (ex "Adventure Network International"). Es una empresa que proporciona vuelos de apoyo logístico a los programas antárticos nacionales y otros proyectos de investigación, a expediciones y visitas al interior de la Antártida.


title: Campamento Glaciar Unión

text: El campamento fue construido cerca de uno de los raros campos de hielo azul, que son lugares de la Antártida en donde no hay acumulación neta anual de nieve. Allí se halla el aeródromo "Union Glacier Blue-Ice Runway SCGC" () que permite el aterrizaje de aviones de transporte con ruedas Ilyushin 76-TD.


title: Campamento Glaciar Unión

text: Desde el glaciar Unión la empresa realiza vuelos al Polo Sur, monte Vinson, la Base Belgrano III, y otras localizaciones utilizando aviones con esquíes Twin Otter y Basler BT-67.


title: Campamento Glaciar Unión

text: Durante los meses de noviembre a enero, cuando las condiciones climáticas no son tan hostiles, se realiza un puente aéreo con Punta Arenas en Chile, con un tiempo de vuelo de alrededor de 4,5 horas.


title: Campamento Glaciar Unión

text: La pista fue certificada por la Dirección General de Aeronáutica Civil (DGAC) de Chile en diciembre de 2008.


title: Campamento Glaciar Unión

text: En noviembre de 2010 la compañía ALE trasladó sus operaciones desde el Campamento Base Patriot Hills, donde operaba desde 1987. La pista de montes Patriot fue conservada como alternativa de seguridad. A fines de 2013 Chile desarmó sus instalaciones en Patriot Hills y las trasladó también al glaciar Unión para crear la Estación Polar Científica Conjunta Glaciar Unión.


title: Línea Roja (Tren Ligero de Seattle)

text: La Central Link del Tren Ligero de Seattle, consiste en 16 estaciones. La línea inicia en la estación Universidad de Washington en Seattle a la estación Angle Lake en SeaTac. La línea inició sus operaciones el 18 de julio de 2009, se expandió hacia la Universidad de Washington en marzo de 2016 y Angle Lake en septiembre de 2016.


title: Creola

text: Creola hace referencia a varios lugares en Estados Unidos:


title: Louisa Chirico

text: Louisa Chirico (nació el 16 de mayo de 1996 en Morristown, Nueva Jersey) es una jugadora de tenis estadounidense.


title: Louisa Chirico

text: Chirico, que viene de Harrison, Nueva York, ha ganado tres singles y dos títulos de dobles en el ITF gira en su carrera. El 9 de mayo de 2016, alcanzó su mejor ranking el cual fue la número 76 del mundo. El 10 de noviembre de 2014, alcanzó el puesto número 210 del mundo en el ranking de dobles.


title: Louisa Chirico

text: La asociación con Jan Abaza, Chirico ganó su primer torneo ITF $ 50 000 en el 2013 Audi Melbourne Pro Tennis Classic, derrotando Asia Muhammad y Allie Will en el último.


title: Brec Bassinger

text: Brec Marie Bassinger (Saginaw, Texas; 25 de mayo de 1999) es una actriz estadounidense. Es conocida por interpretar a Bella Dawson en la serie de Nickelodeon "Bella and the Bulldogs" y a Courtney Whitmore/Stargirl en la serie de DC Stargirl.


title: Brec Bassinger

text: Bassinger solía presentarse a concursos de belleza y tiene dos hermanos mayores llamados Beric y Brice. Fue diagnosticada con diabetes tipo 1 a los 8 años de edad. Antes de convertirse en actriz, era una competitiva animadora.


title: Jane Porter

text: Jane Porter (Durham, 17 de enero de 1776 – Brístol, 24 de mayo de 1850) fue una novelista histórica, dramaturga y literata británica.


title: Jane Porter

text: Nació en Durham como la tercera de los cinco hijos de Jane y William Porter. Cuando creció fue alta y hermosa. Su gesto grave le valió el apodo de «La Penserosa» (, «la chica pensativa»). Tras la muerte de su padre, su familia se mudó a Edimburgo, donde Walter Scott era un asiduo visitante. Tiempo después, la familia se trasladó a Londres, donde las hermanas se familiarizaron con un número de mujeres literatas: Elizabeth Inchbald, Anna Laetitia Barbauld, Hannah More, Elizabeth Hamilton, Elizabeth Benger y la sra. Champion de Crespigny.


title: Jane Porter

text: Los hermanos de Porter también lograron cierta fama en su vida; su hermana Anna Maria Porter también fue novelista —tuvo talento precoz para la poesía paisajista, pero no lo profundizó como Jane—; su hermano Robert Ker Porter fue un pintor y viajero.


title: Jane Porter

text: Se considera que Porter fue «diseñadora y pionera de muchas de las herramientas narrativas más comúnmente asociadas a la historia nacional y la novela histórica». Su obra de 1803 "Thaddeus of Warsaw" es uno de los primeros ejemplos de novela histórica y pasó por al menos 84 ediciones, que incluye una traducción al francés y al alemán. Por su publicación se le concedió la elección como canonesa de la Orden Teutónica de San Joaquín. El héroe epónimo de la novela de Porter es Thaddeus Sobieski, un descendiente ficticio del rey Juan Sobieski, quien lucha al lado de los ejércitos invasores rusos y prusianos. Sobre la base de relatos oculares de refugiados polacos que huían de las fallidas revueltas contra la ocupación extranjera de Polonia en los años 1790, la obra fue elogiada por Tadeusz Kościuszko, un héroe de la Revolución estadounidense.


title: Jane Porter

text: "The Scottish Chiefs" (1809), una novela sobre William Wallace, también fue un éxito (la versión francesa fue prohibida por Napoleón), y se ha mantenido popular entre los chicos escoceses. "The Pastor's Fireside" (1815) era una historia sobre los Estuardo tardíos.


title: Jane Porter

text: Contribuyó a revistas y escribió la pieza teatral "Switzerland" (1819), que parece haber sido saboteada deliberadamente por su protagonista Edmund Kean y cerrada después de su primera actuación. En ocasiones se le «acredita» la producción de 1822 "Owen, Prince of Powys", que se cerró después de solo tres actuaciones, pero en realidad esto fue trabajo de Samson Penley. También escribió "Tales Round a Winter Hearth" (1821), "Coming Out" (1828), y "The Field of Forty Footsteps" (1828) con su hermana, Anna Maria.


title: Jane Porter

text: Un drama romántico, "Sir Edward Seaward's Diary" (1831), que pretendía ser un registro de circunstancias reales, fue editado por Jane y escrito por su hermano, el Dr. William Ogilvie Porter, mediante cartas, ahora exhibidas en la Universidad de Durham.


title: Jane Porter

text: En sus últimos años, continuó escribiendo piezas más cortas para revistas. Muchas fueron publicadas de manera anónima o simplemente con «JP». Sus temas de amplio alcance incluyeron a Pedro el Grande, Simón Bolívar y Dixon Denham.


title: Jane Porter

text: Después de visitar Rusia con su hermano Robert Ker, regresó a Inglaterra a su vieja residencia en Brístol, donde murió el 24 de mayo de 1850.


title: Jane Porter

text: Como muchos de sus contemporáneos, estuvo atraída por la fama de Lord Byron. El villano en "The Pastor's Fireside", el Duque de Wharton, dijo en su diálogo que tenía «una sombra inequívocamente byrónica». Influencias adicionales en la escritura de Porter incluyen a su maestro George Fulton, así como "La Reina Hada" de Edmund Spenser y "Arcadia" de Philip Sidney.


title: Henriette Petit

text: Henriette Petit, seudónimo de Ana Enriqueta Petit Marfan (Santiago, 3 de marzo de 1894 - ibíd., 9 de diciembre de 1983), fue una pintora chilena, miembro del grupo Montparnasse, del que fue cofundadora.


title: Henriette Petit

text: Comenzó su carrera a inicios de la década de 1910, cuando se hizo discípula de Juan Francisco González —considerado uno de los cuatro «grandes maestros de la pintura chilena»—, a quien conoció por intermedio de su amiga, la también pintora Marta Villanueva. Ingresó a la Escuela de Bellas Artes en 1914, y dos años más tarde pintó su primer cuadro.


title: Henriette Petit

text: Viajó a Europa junto a su familia entre 1920 y 1921, periodo en el que tuvo clases en París, Francia, con el escultor Antoine Bourdelle, quien la retrataría en un busto titulado "Le Chilienne" y cuyas variantes se encuentran en el museo del artista. En 1923, ya de regreso en Chile, se une al grupo Montparnasse, movimiento vanguardista de influencias del postimpresionismo y del fovismo que también integraron Luis Vargas Rosas —con quien se casaría en 1927 teniendo como padrino de boda al poeta Vicente Huidobro—, José Perotti y los hermanos Julio y Manuel Ortiz de Zárate.


title: Henriette Petit

text: En 1926 se asentó en París, donde continuó especializándose en croquis, dibujo y pintura, e integró el ambiente artístico donde compartió con, entre otros, los franceses Le Corbusier y Fernand Léger, los españoles Juan Gris, Joan Miró y Pablo Picasso, el británico William Hayter y el estadounidense Alexander Calder. En la capital francesa, además de dedicarse a la pintura, trabajó en el hospital psiquiático Henri-Rousselle. El matrimonio de Henriette Petit y Luis Vargas Rosas regresó a Chile en 1941, debido a la Segunda Guerra Mundial. La producción artística de Petit decayó notablemente debido al desarraigo que le provocó estar lejos de Francia, que mantuvo hasta su último viaje al país galo en 1963.


title: Clasificación de UEFA para la Copa Mundial de Fútbol Playa FIFA 2015

text: La clasificación de la UEFA para la Copa Mundial de Fútbol Playa FIFA 2015 fue un torneo de fútbol playa que se desarrolló en Jesolo, Italia, desde el 5 al 14 de septiembre de 2014, en el que se determinaron los cuatro equipos clasificados de Europa. Todos los partidos se jugaron en el estadio Beach Arena del Faro di Jesolo. Las selecciones que llegaron a las semifinales del torneo y lograron la clasificación para la copa del mundo fueron Rusia, ganadora del evento, Suiza, Italia, y España.


text: Los 24 equipos participantes fueron divididos en 6 grupos de 4 integrantes. Tras una ronda de todos contra todos, clasificaron dieciséis equipos que fueron emparejados para definir a ocho clasificados, que posteriormente fueron nuevamente divididos en cuatro grupos de cuatro participantes sobre la base de sus resultados. El mejor de cada grupo clasificaron a la copa mundial y también definieron el campeón del torneo.


text: En esta fase los veinticuatro equipos fueron divididos en seis grupos de cuatro integrantes y buscaron la clasificación en una ronda de todos contra todos. Pasaron a la siguiente fase los dos primeros lugares de cada grupo y los cuatro mejores terceros puestos.


text: En esta fase los 16 equipos fueron divididos en cuatro grupos de cuatro integrantes y buscaron la clasificación en una ronda de todos contra todos. Los primeros lugares de cada grupo clasificaron a la Copa Mundial de Fútbol Playa FIFA 2015.


text: Se jugó para determinar al campeón, subcampeón, tercer y cuarto lugar.


title: Aeródromo Wilkins

text: El aeródromo Wilkins (en inglés: "Wilkins Runway") es un aeródromo de la Antártida operado por Australia, y localizado sobre el glaciar Peterson, en la costa Budd de la Tierra de Wilkes, a 40 km de la costa. Recibió su nombre en homenaje a sir Hubert Wilkins, un pionero de la aviación polar y explorador.


title: Aeródromo Wilkins

text: La construcción de una pista aérea en el Territorio Antártico Australiano fue primero sugerida en la década de 1950, pero por cuestiones logísticas, políticas y medioambientales la construcción no comenzó hasta 2004. El aeródromo se encuentra a unos 65 km de la base Casey.


title: Aeródromo Wilkins

text: Con el fin de ser aprobado por la "Civil Aviation Safety Authority" (CASA) de Australia, la pista de Wilkins debió ser nivelada con el uso de láseres, y requiere un equipo de ocho personas para mantener el nivel y la fricción de la pista antes de cada aterrizaje.


title: Aeródromo Wilkins

text: CASA emitió una licencia a la línea aérea Skytraders para operar vuelos de pasajeros, y el primer vuelo se realizó el 11 de enero de 2008, llevando al ministro medioambiental australiano Peter Garrett, doce científicos y otros seis pasajeros.


title: Aeródromo Wilkins

text: Los vuelos a la Antártida parten del Aeropuerto Internacional de Hobart en Tasmania usando un Airbus A319, y duran alrededor de 4 horas. Antes de la finalización de la pista, el viaje a la Antártida implicaba diez días por barco a través del océano Austral desde Hobart. El aeródromo sólo funciona durante el verano antártico, y se han previsto veinte a treinta vuelos por temporada. Los vuelos se utilizan para el transporte de los científicos que realizan investigaciones en la Antártida, y no están disponibles para vuelos turísticos. Sin embargo, desde la apertura de la pista de aterrizaje no hubo más de 10 vuelos por temporada. Esto se debe principalmente a las condiciones ambientales en el sitio, las temperaturas son más cálidas y causan la fusión de la pista, lo que disminuye la ventana de oportunidad de utilizar la pista de aterrizaje. A partir de enero de 2012 se planificaron sólo cuatro vuelos para la temporada de verano y todos en febrero de 2012.


title: Reacción en cadena de la polimerasa múltiple

text: La Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (PCR Múltiple) es una variante de la PCR tradicional (PCR punto final) en la que dos o más loci se amplifican simultáneamente en la misma reacción. Es una técnica de biología molecular usada en todo el mundo que usa la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar distintos fragmentos de ADN diana simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones en cadena de la polimerasa individuales en una misma reacción). La amplificación de las dianas se logra mediante el uso de múltiples pares de cebadores en una mezcla de reacción; el diseño de los cebadores para todos los pares de estos tiene que ser optimizado para que pueden trabajar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR. La PCR Múltiple tiene el potencial de ahorrar considerablemente tiempo y esfuerzo en el laboratorio, sin comprometer la utilidad del experimento. Desde su primera descripción en 1988, este método se ha aplicado con éxito en muchas áreas de diagnóstico de ácidos nucleicos, incluidos el análisis de deleción de genes, mutaciones, polimorfismos, ensayos cuantitativos, detección de RNA y PCR de transcripción inversa. Kits de alcance comercial para realizar PCR Múltiple están disponibles y son utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradadas. En el campo de las enfermedades infecciosas, esta técnica ha demostrado ser un método valioso para la identificación de virus, bacterias, hongos, y parásitos.


text: La PCR Múltiple fue descrita por primera vez en 1988 por Chamberlain, Gibbs, Ranier, Nguyen y Caskey como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina (uno de los genes humanos más largo que se conocen, con 2,5 megabases), que son la causa de la Distrofia Muscular de Duchenne. En 1990, Ballabio, Ranier, Chamberlain, Zollo, and Caskey la usaron como método de screening para encontrar deleciones en el gen de la esteroide sulfatasa (STS). En 2008, La PCR Múltiple fue utilizada para el análisis de microsatélites y SNPs, entre muchas otras áreas.


text: La PCR, en general, ha revolucionado el campo del diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Para superar la desventaja inherente del alto costo y para mejorar la capacidad diagnóstica de la prueba, se ha desarrollado la PCR Múltiple para la detección de agentes infecciosos virales, bacterianos y fúngicos en un tubo de reacción. Los esfuerzos para mejorar la sensibilidad y especificidad, y para facilitar la automatización del proceso han dado lugar a numerosas publicaciones relacionadas con la aplicación de la PCR Múltiple en el diagnóstico de agentes infecciosos, especialmente aquellos que se dirigen a ácidos nucleicos virales.


text: La PCR Múltiple consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de tamaños que son específicos para varias secuencias de ADN diferentes. Aunque no está claro si hay un límite teórico para el número de secuencias que pueden amplificarse simultáneamente, las limitaciones en el establecimiento de condiciones para reacciones específicas e interpretables generalmente limitan el número de secuencias diana útiles. Una reacción de PCR Múltiple para amplificar tanto como nueve segmentos del gen de la distrofina humana ya ha sido reportado con anterioridad.


text: El desarrollo de la PCR Múltiple debería seguir un enfoque racional para sus condiciones, tales como la compatibilidad entre los cebadores dentro de la mezcla de reacción de tal manera que no haya interferencias entre ellos, lo cual es de gran importancia técnica. Por lo tanto, el diseño de los conjuntos de cebadores de acuerdo con unos parámetros claramente identificados es esencial para una amplificación específica con alto rendimiento.


text: Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben ser optimizadas para que puedan funcionar correctamente dentro de una sola reacción, utilizando los pares de cebadores que resulten en productos de PCR que pueden ser separados y visualizados claramente mediante electroforesis en gel o hibridación de sondas con máxima especificidad. Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y visualizarse usando cebadores que se han teñido con diferentes colores de marcas fluorescentes.


text: La longitud del cebador debe ser de 18 a 24 pares de bases y debe tener un contenido de GC de entre el 40 % y el 60 %, por lo tanto deberían de tener una temperatura de hibridación de 55 °C a 58 °C. Los cebadores más largos, de entre 28 y 30 pares de bases, permiten que la reacción se realice a una temperatura de hibridación más alta, pero los rendimientos de los productos resultarán ser inespecíficos, o se dará la formación de dímeros de cebadores. Se recomienda calcular el punto de fusión y hacer pruebas para posibles interacciones cebador-cebador. También se recomienda hacer pruebas de posibles secuencias repetitivas, intente alineación de cebadores con las bases de datos de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) usando la familia de programas de la Herramienta de Búsqueda de Alineación Básica Local (BLAST, por sus siglas en inglés).


text: Se utilizan cebadores con la temperatura de fusión similar, preferiblemente entre 55 °C y 60 °C. Para las secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una temperatura de fusión más alta (preferiblemente de 75 °C a 80 °C). Una variación de entre 3 °C y 5 °C es aceptable para los cebadores utilizados en la reacción.


text: Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores diseñados con las secuencias diana, mientras se realiza la preparación de una PCR Múltiple, sobre todo porque existe competencia cuando múltiples secuencias diana están en un solo recipiente de reacción.


text: Los cebadores diseñados deben ser revisados para que no ocurra la formación de dímeros de cebadores, ya que con todos los que habrá presentes en la mezcla de reacción, si llega a haber dimerización, esta conduce a la amplificación inespecífica de fragmentos.


text: Las PCR Múltiples deben evitar el uso de cebadores anidados que requieren una segunda ronda de amplificación. Esto es un importante contribuyente de los resultados con falsos positivos debido a la contaminación por arrastre, aunque protocolos anti-contaminación incluyendo controles de PCR (reacción y las muestras extraídas de controles) deben ser implementadas en todos los protocolos basados en la PCR. Del mismo modo, las precauciones y metodologías para evitar resultados falsos negativos debido a la insuficiencia de reacción tienen que ser considerados. Las PCR Múltiple que amplifican secuencias diana junto con la presencia de ácidos nucleicos diana de control externos o internos que indican la insuficiencia de reacción ya se han desarrollado y han sido también ampliamente utilizados.


text: Las reacciones múltiples pueden ser categorizadas en dos grupos:


text: 1. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Templete Único


text: Esta técnica utiliza una única plantilla que puede ser un ADN genómico junto con varios pares de cebadores directo e inverso para amplificar regiones específicas dentro de un templete.


text: 2. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Múltiples Templetes


text: Se utilizan múltiples plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo de reacción. La presencia de múltiples cebadores puede dar lugar a hibridación cruzada entre sí y así propiciar la posibilidad de errores de alineación con otras plantillas.


text: 1. Controles Internos


text: Los problemas potenciales en una PCR simple incluyen falsos negativos debido a alguna falla en reacción o falsos positivos debido a alguna contaminación. Los falsos negativos a menudo se revelan en ensayos múltiples porque cada amplicón proporciona un control interno para los otros fragmentos amplificados.


text: 2. Eficiencia


text: El gasto de los reactivos y el tiempo de preparación es menor en una PCR Múltiple que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR. Una reacción múltiple es ideal para la conservación de la polimerasa, que es costosa y de plantillas con escasa cantidad.


text: 3. Calidad del Templete


text: 4. Cantidad del Templete


text: La amplificación exponencial y los estándares internos de la PCR Múltiple se pueden utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una muestra. Para cuantificar las plantillas con precisión por PCR Múltiple, la cantidad de plantilla de referencia, el número de ciclos de reacción y la inhibición mínima de la duplicación teórica de producto para cada ciclo deben tenerse en cuenta.


text: 5. Cantidad Limitada de Templete


text: La cantidad de extracto disponible de ADN antiguo es limitado y solo permite unos cuantos ensayos de PCR. El protocolo de la PCR Múltiple permite varios órdenes de magnitud de mayor información para ser deducidas de cantidades limitadas de plantilla. Esto se logra mediante la amplificación de un número casi ilimitado de fragmentos de la misma cantidad de plantilla de ADN como se utilizaría para un producto de PCR estándar único.


text: 6. Modificaciones


text: En primer lugar, debido a su alta especificidad cuando se utilizan cebadores anidados, un muy alto número de loci puede ser amplificado simultánea- y rápidamente sin la necesidad de la optimización previa de las diferentes combinaciones de cebadores. La alta especificidad es proporcionada por cebadores anidados, que imponen un nivel adicional de selección de secuencia en los productos de la primera PCR. Este diseño reduce sustancialmente la aparición de espurios de cebadores y falsos positivos debido a la amplificación no específica o amplificación de ADN contaminante a partir de especies diferentes a la especie objetivo. En segundo lugar, solo los fragmentos más cortos (anidados) de la segunda etapa se amplifican a un alto número de copias. Por lo tanto, el riesgo de contaminación cruzada de muestras posteriores con productos de la PCR se reduce, ya que estos productos más cortos no pueden servir como plantillas para la primera etapa.


text: 7. Aplicaciones


text: Tales como la amplificación paralela de múltiples locis cortos que no presentan solapamiento, por lo que se puede utilizar un único conjunto de cebadores múltiples. La técnica también puede ser adaptada para el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), por ejemplo para inferir la selección positiva, la distribución geográfica de los alelos o cambios en la distribución del alelo en un tiempo y en un espacio determinados. Recientemente, se ha propuesto que la secuenciación de un genoma completo de una especie extinguida utilizando la técnica 454 proporcionará un gran número de SNPs para especies extintas. El protocolo de PCR Múltiple de dos etapas proporciona un método para la evaluación rápida de algunos SNPs candidatos y la posterior tipificación en paralelo de cientos o miles de SNPs de una muestra. Usando fuentes complejas de ADN, tales como las heces o sedimentos, también podría ser posible amplificar el ADN de especies diferentes, tales como plantas, animales y bacterias simultáneamente. Finalmente, este método tiene muchas aplicaciones en medicina forense, ya que permite el análisis simultáneo de múltiples marcadores tales como el ADN mitocondrial, los marcadores específicos del sexo, microsatélites y SNPs de las muestras de cantidad limitada.


text: 1. Número limitado de pares de cebadores


text: El número de pares de cebadores está limitado por el aumento de la posibilidad alineamiento incorrecto; aunque cabe mencionar que existen protocolos de PCR Múltiple en los que utilizan hasta 1,200 pares de cebadores y un solo templete de ADN y se ha logrado trabajar exitosamente.


text: 2. Optimización


text: La PCR Múltiple requiere de varios aspectos que requieren ser optimizados, como los componentes o las condiciones del termociclador, de acuerdo al tipo de experimento, investigación o diagnóstico que se desea realizar, y también para que se alcance una alta eficiencia y rendimiento.


text: 3. Validación


text: Antes de su aplicación en el diagnóstico clínico, las PCR Múltiple deben ser evaluadas por su sensibilidad en comparación con sus correspondientes PCR Simples usando diluciones en serie del ADN diana y muestras clínicas en ambas.


text: Algunas soluciones y reactivos estándar para PCR Múltiple son:


text: Nucleótidos, desoxinucleótidos trifosfato o dNTP, que se almacenan como una solución stock de 100 mM (25 mM para dATP, 25 mM para dCTP, 25 mM para dGTP y 25 mM para dTTP).


text: Amortiguador para PCR Estándar 10x, que deberá contener: 500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl, pH ajustado a 8.3 (a 24 °C) y 15 mM de MgCl2.


text: "Taq "ADN Polimerasa.


text: Aditivos como dimetil sulfóxido o DMSO, albúmina de suero bovino o BSA y glicerol.


text: Cebadores que pueden ser adquiridos comercialmente o sintetizados localmente; deben ser utilizados a una concentración final recomendada de 10 a 25 pmol/µL cada uno y pueden combinarse en múltiples mezclas para la reacción.


text: ADN Genómico que se recomienda que sea preparado utilizando un protocolo estandarizado de dodecil sulfato de sodio / proteinasa K.


text: Algunos componentes de la PCR deben permanecer inalterados, ya que el aumento de la concentración de estos factores puede aumentar la probabilidad de alineamientos inespecíficos de los cebadores con la subsiguiente producción de productos de amplificación igualmente inespecíficos o espurios. Estos son: componentes del tampón o amortiguador para PCR, nucleótidos y concentraciones de la polimerasa.


text: Sin embargo, la optimización de estos componentes en PCR Múltiple, que están diseñados para la amplificación simultánea de múltiples objetivos, puede resultar beneficiosa debido a que el ADN diana deseado puede ser desplazado por la amplificación más eficiente de otras dianas (incluidos los productos no específicos), lo que lleva a la disminución de la eficiencia de la amplificación de los objetivos deseados y por lo tanto a la disminución en la sensibilidad de la reacción.


text: Por ejemplo, en la PCR Múltiple utilizada para el gen de la distrofina (nueve dianas genómicas), una concentración de "Taq" ADN polimerasa (con un aumento apropiado de la concentración de MgCl2) de cuatro a cinco veces mayor que la requerida en la PCR Simple fue necesaria para lograr una óptima amplificación de ácidos nucleicos.


text: Otra técnica de optimización de los componentes es el uso de aditivos para PCR, tales como dimetil sulfóxido, glicerol, albúmina de suero bovino o betaína, que han sido analizadas y se ha comprobado su carácter beneficioso para PCR Múltiple. Los componentes pueden actuar para prevenir el estancamiento de la polimerización de ADN, que puede ocurrir a través de la formación de estructuras secundarias dentro de las regiones de ADN molde durante el proceso de extensión. Tales co-disolventes también pueden actuar como agentes desestabilizadores, ayudando en la reducción de la temperatura de fusión de las secuencias ricas en GC, por poner un ejemplo.


text: Un protocolo de PCR Múltiple Paso-a-Paso fue diseñado por Henegariu, Heerema, Dlouhy, Vance y Vogt en 1997, con soluciones prácticas a muchos de los problemas que se encuentran en esta variante de la PCR. La combinación óptima de la temperatura de hibridación y la concentración de sal en el amortiguador es esencial en cualquier PCR para obtener productos de amplificación altamente específicos. La concentración de cloruro de magnesio solamente necesita ser proporcional a la cantidad de dNTP en la reacción, y estos valores pueden permanecer constantes para cualquier reacción. Aunque si las concentraciones de cloruro de magnesio se aumentaran gradualmente, podrían influir aún más la reacción, los otros dos parámetros mencionados parecen ser mucho más importantes en la obtención de altos rendimientos y alta especificidad de los productos de PCR. En la PCR Múltiple, ajustar la cantidad de cebador para cada locus también se ha demostrado ser esencial, entre muchos otros.


text: 1. Escoger un loci.


text: Determinar el sistema de PCR a utilizar.


text: Distribuir los amplicones (localizados en los “puntos calientes” o lugares donde frecuentemente ocurren mutaciones, ligados a genes, cromosomalmente no ligados, agrupados cerca de exones en un mismo amplicón, etc…).


text: Diseñar fragmentos de control interno (otros exones, secuencias externas, secuencias del modelo, secuencias conservadas en todos los templetes diana, etc…).


text: 2. Posicionar los Cebadores en regiones de secuencias detalladas; en relación al tamaño de los amplicones.


text: 3. Diseño de Cebadores con cinéticas de reacción similares.


text: 4. Desarrollar las Condiciones para PCR de manera separada para cada set de cebadores.


text: 5. Añadir Secuencialmente los sets de Cebadores, alterando las condiciones como sea necesario. Reducir las amplificaciones inespecíficas (hot start, detergentes iónicos, tiempos cortos de extensión, hibridación a la máxima temperatura posible, reseleccionar la secuencia de los cebadores). Variar las concentraciones relativas de los sets de cebadores para amplificación equivalente. Cambiar los sistemas de amortiguamiento si es necesario.


text: 6. Ajustar los componentes de la reacción y las condiciones del termociclador para la amplificación múltiple. Los requerimientos de Mg2+, dNTP y polimerasa pueden verse incrementados. Los tiempos para la extensión ideal pueden prolongarse un poco más de lo planeado.


text: La identificación de las especies objetivo debe ser realizada, las secuencias pueden ser recuperadas de bases de datos como GenBank. Partes de los genes tienen que ser secuenciadas para todas las especies diana utilizando cebadores. Las secuencias necesitan ser alineadas utilizando softwares disponibles para tal propósito, como por ejemplo BioEdit, y pares de cebadores específicos diseñados utilizando otros softwares como los que pone a disposición del público la empresa Premier Biosoft. Durante el diseño, los pares de cebadores deben ser equilibrados para temperaturas de fusión y se debe tratar de evitar la formación de dímeros cruzados.


text: La PCR básica de 25 µL incluye: agua ultrafiltrada y autoclavada; amortiguador para PCR (1x); mezcla de dNTP (200 µM cada uno); cebadores (0.04–0.6 µM cada uno); DMSO, glicerol o BSA (5% - en caso de utilizarlos); "Taq "ADN polimerase (1–2 U/25µL) y templete de ADN genómico(150 ng/25 µL).


text: Los componentes de la reacción pueden ser añadidos en orden indistinto siempre que se haya añadido primero el agua ultrafiltrada y autoclavada.


text: Los fragmentos son amplificados a partir de la plantilla de ADN usando los cebadores diseñados, un fragmento de ADN se genera para cada diana incluida en la PCR Múltiple, que abarca los sitios de unión de cebadores específicos.


text: Los productos de PCR se pueden limpiar con kits de purificación de PCR y la cantidad de ADN se puede medir utilizando equipos de cuantificación como espectrofotómetros. La cuantificación de ADN se debe determinar como el promedio de tres mediciones individuales de cada producto. El peso molecular de cada fragmento de doble cadena puede calcularse a partir de la secuencia de ADN correspondiente.


text: Una evaluación minuciosa y una validación de nuevos procedimientos de PCR Múltiple es esencial. La sensibilidad y especificidad del método deben ser evaluados a fondo con el uso de ácidos nucleicos estandarizados, purificados. Se debe hacer un uso completo de controles de calidad internos y externos, que deben aplicarse rigurosamente. Cuando se trabaja con microorganismos, al aumentar el número de agentes microbianos detectables por la PCR, será altamente deseable para fines prácticos lograr la detección simultánea de múltiples agentes que causan síndromes clínicos similares o idénticos y que comparten características epidemiológicas similares.


text: Los productos de PCR Múltiple pueden ser analizados por electroforesis en geles de agarosa en TAE 1x (0,04 M Tris-acetato, 0,001 M EDTA, a pH 8,0) o TBE 1x (0,09 M Tris-borato, 0,002 M EDTA, a pH 8,0) amortiguador, a temperatura ambiente usando gradientes de tensión de 7-10 V / cm. Para cualquier análisis en gel, el mismo volumen de productos de la PCR se carga en cada pozo de gel; o en geles de secuenciación (6% de poliacrilamida, que se utilizan para la separación de los productos de PCR cuando se tienen polimorfismos o se requiere de una resolución más alta. Además, un sistema de electroforesis capilar automatizado se puede utilizar para realizar el mismo análisis, para la separación y visualización de productos de PCR, donde las diferencias de longitud del amplicón de tan solo unas 20 pares de bases son adecuados para diferenciar entre dianas dentro del sistema Múltiple. Incluso hay aparatos que permiten la visualización en electroferogramas, donde las unidades fluorescentes relativas (RFU) proporcionan una medida de la intensidad de señal de los fragmentos detectados.


text: Se puede ajustar el sistema Múltiple para obtener la misma eficiencia de amplificación de la siguiente manera: antes de la amplificación múltiple, todos los pares de cebadores requieren ser probados en PCRs Simples a la temperatura estimada de hibridación óptima para comprobar la correcta amplificación de los fragmentos deseados. Entonces, un primer sistema Múltiple provisional se prueba. Condiciones de 15 min a 95 °C, 35 ciclos de 30 °C a 94 °C, 90s a 62 °C a 65 °C, 60s a 72 °C y la elongación final por 10 min a 72 °C, comprobando que no hay fragmentos adicionales producidos por cualquiera de los cebadores dentro del sistema Múltiple. El sistema Múltiple se prueba entonces en una PCR en gradiente con extractos individuales y una mezcla de todos los taxones diana para determinar la temperatura óptima de hibridación. Por último, las concentraciones de cebadores se ajustan por pasos disminuyendo aquellos pares que dieron lugar a las señales relativamente fuertes y aumentando los productores de bandas más débiles. El sistema Múltiple final, resulta en la fuerza equivalente de señales para todos los objetivos cuando se utiliza una mezcla de plantilla de ADN estandarizada.


text: Para estimar la sensibilidad de los pares de cebadores en el sistema Múltiple, el número mínimo de copias de plantilla de doble hebra plantilla copias necesarias para amplificar un producto se identifica a todos los objetivos en diversas condiciones:


text: La optimización de la PCR Múltiple puede plantear varias dificultades, incluida la baja sensibilidad y especificidad, y la amplificación preferencial de ciertas dianas específicas. La presencia de más de un par de cebadores en la PCR Múltiple aumenta la probabilidad de obtener productos de amplificación no esenciales, principalmente debido a la formación de dímeros de cebadores. Estos productos inespecíficos pueden ser amplificados más eficientemente que la diana deseada, consumir los componentes de la reacción y producir tasas alternativas de hibridación y extensión. Uno de los conceptos más importantes en la PCR es el de la relación óptima entre el cebador y la plantilla. Si la relación es demasiado alta, se forman dímeros de cebadores, como ocurre también en condiciones de plantilla muy diluida o si existe un exceso de cebador. Para la mayoría de las aplicaciones, independientemente de la concentración de plantilla, la concentración de cebador no puede elevarse mucho más que 0,5 mM debido a la formación de dímeros. Por lo tanto, lo que determina la relación de cebador a la plantilla es la cantidad y la complejidad de la plantilla proporcionada a la reacción. Si la relación de cebador a la plantilla es demasiado baja, el producto no se acumulará de forma exponencial, desde hebras diana recién sintetizados volverán a hibridarse después de la desnaturalización (que reduce el rendimiento considerablemente), o inhibirá la formación de producto de PCR.


text: Cuando más de una única diana será amplificada a partir de la plantilla, es necesario ajustar la relación de cebador-plantilla para evitar la formación de dímeros de cebadores. La optimización de PCR múltiple debe tratar de minimizar estas interacciones no específicas. Las pruebas empíricas y un enfoque de ensayo y error pueden tener que ser utilizados al probar varios pares de cebadores, porque no hay manera de predecir las características de funcionamiento de un par de cebadores seleccionado incluso entre aquellos que cumplen con los parámetros generales del diseño de cebadores. Tienen que ser considerados con especial atención los parámetros para el diseño de cebadores, como homología de los cebadores con sus secuencias diana de ácidos nucleicos, su longitud, su contenido en GC y su concentración.


text: La PCR Hot Start a menudo elimina las reacciones inespecíficas causadas por hibridación de cebadores a bajas temperaturas (entre 4 °C y 25 °C) antes del inicio del termociclado. Idealmente, todos los pares de cebadores en una PCR Múltiple deben permitir eficiencias de amplificación similares para sus respectivos ADN objetivos, que se logra mediante la utilización de cebadores con temperaturas de hibridación óptimas, casi idénticas y no deben mostrar una homología significativa ya sea para consigo mismos o entre ellos.


text: La amplificación preferencial de una secuencia diana sobre otra es un fenómeno conocido en la PCR Múltiple. Basado tanto en el modelado teórico como en los estudios experimentales, dos clases principales de procesos que inducen este sesgo han sido identificados: la deriva de PCR y la selección de PCR.


text: La deriva de PCR es un sesgo supuestamente debido a la fluctuación estocástica en las interacciones de los reactivos de PCR, particularmente en los primeros ciclos, lo que podría surgir en la presencia de concentraciones muy bajas de la plantilla; variaciones en los perfiles térmicos del termociclador, resultando en temperaturas de rampa desiguales; o simplemente por algún error experimental.


text: La selección de PCR se define como un mecanismo que favorece la amplificación de ciertas plantillas debido a las propiedades de la diana, las secuencias flanqueantes del objetivo, o de todo el genoma diana. Estas propiedades incluyen las diferencias entre regiones en el contenido de GC, lo que lleva a la desnaturalización preferencial; una mayor eficiencia de unión debido a cebadores ricos en GC; accesibilidad diferencial de los objetivos dentro de los genomas debido a estructuras secundarias; y el número de copias del gen dentro de un genoma. Además, la elección de cebadores se ha demostrado ser crucial para evitar la selección PCR.


text: Inicialmente, concentraciones equimolares de cebadores se utilizan en la PCR Múltiple. Cuando hay amplificación desigual, con algunos de los productos apenas visibles incluso después de que la reacción fue optimizada para las condiciones del ciclo, cambiando las proporciones de los diferentes cebadores en la reacción que se requiere, con un aumento en la cantidad de cebadores para los loci "débiles" y una disminución en la cantidad para los loci "fuertes". La concentración final de los cebadores puede variar considerablemente entre los loci y se establece empíricamente. Si hay un bajo número de copias o un ADN de alta complejidad, la concentración de los cebadores deberá rondar el 0.4 µM. Si hay un alto número de copias o un ADN de baja complejidad, la concentración de los cebadores debería de ser de entre 0.04 µM y 0.4 µM.


text: "dNTP"


text: La concentración de cloruro de magnesio se debe de mantener constante (2 mM), mientras que la concentración de dNTP se incrementa paso a paso desde 0,5 hasta 1,6 mM. Los mejores resultados se han reportado entre 200 mM y 400 mM de cada dNTP, valores por encima de este último han reflejado que la amplificación se inhibe rápidamente. Cuando se ha aplicado una baja concentración de dNTP (100 mM de cada uno) la amplificación por PCR se ha llevado a cabo generando cantidades visiblemente más bajas de productos. Los dNTP son sensibles a los ciclos de descongelación y congelación. Después de entre tres y cinco de dichos ciclos, la PCR múltiple no se realiza a una eficiencia recomendada. Para evitar estos problemas, pequeñas alícuotas de dNTP se pueden hacer y mantener congeladas a -20 °C. Esta reducción en la estabilidad de los dNTP no es tan evidente cuando se amplifican loci individuales, o sea en PCR punto final.


text: "MgCl2 "


text: Una concentración recomendada de cloruro de magnesio en una PCR estándar es de 1.5 mM siempre que la concentración de dNTP sea de alrededor de 200 mM cada uno. Anteriormente se ha probado la influencia de cloruro de magnesio, manteniendo la concentración de dNTP a 200 mM y aumentando gradualmente cloruro de magnesio 1,8 a 10,8 mM; con esta última concentración de cloruro de magnesio, la amplificación se hizo más específica (bandas inespecíficas desaparecieron) y los productos adquirieron una intensidad comparable. En otras PCR con hasta 20 mM MgCl2, los productos apenas fueron distinguibles como si hubieran sido inhibidos en las reacciones.


text: "Balance" "de" "dNTP/MgCl2"


text: Para que funcione correctamente, la "Taq" ADN polimerasa requiere magnesio libre (además del magnesio obligado por el dNTP y el ADN); esta es probablemente la razón por la que aumentar las concentraciones de dNTP puede inhibir rápidamente la PCR, mientras que los incrementos en la concentración de magnesio a menudo tienen efectos positivos. Mediante la combinación de varias cantidades de dNTP y MgCl2, se encontró que 200 mM de cada dNTP trabajó bien en 1,5-2 mM MgCl2. El umbral para la reacción fue de aproximadamente 0,5-1 mM MgCl2 sobre la concentración total de dNTP, con una reducción de la amplificación por PCR por debajo de esta concentración de MgCl2.


text: El aumento de la concentración del tampón o amortiguador para PCR a 2X mejora la eficiencia de la reacción múltiple. Esto fue más eficaz que cualquiera de los adyuvantes probados: sulfóxido de dimetilo (DMSO), glicerol y albúmina de suero bovino (BSA). Los pares de cebadores que resultaron en productos de amplificación más largos, fueron los que funcionan mejor en menores concentraciones de sales, mientras que los pares de cebadores con productos de amplificación cortos funcionan mejor en altas concentraciones de sal.


text: "Comparación de amortiguadores"


text: Dependiendo de los cebadores que se usen, el amortiguador basado en KCl es menos complejo y más fácil de ajustar y optimizar. Además, dado que la eficiencia de la "Taq "ADN polimerasa es mayor a concentraciones de dNTP inferiores, utilizando el amortiguador basado en KCl (que requiere mucho menos dNTP) puede ser beneficioso cuando los productos de PCR deben ser analizados más de mutaciones.


text: Cuando la cantidad de ADN molde es muy baja (pg de ADN), la amplificación puede hacerse más eficiente y específica mediante la reducción de la temperatura de hibridación hasta de 10 °C y 12 °C. Diferentes concentraciones de "Taq" ADN polimerasa han sido probadas con anterioridad y la más eficaz parece ser alrededor de 2,5 U / 50 L de volumen de reacción. La concentración excesiva de enzima, posiblemente debido a la alta concentración de glicerol en la solución, se traduce en una amplificación desequilibrada de diversos loci. La tasa de extensión de los híbridos de los cebadores específicos depende de la actividad de la enzima, la disponibilidad de los componentes esenciales, tales como MgCl2, dNTPs y la naturaleza del ADN molde. Por lo tanto, la mayoría de las modificaciones para mejorar el rendimiento de PCR debe dirigirse a los factores que afectan las tasas de hibridación y amplificación.


text: Las reacciones más difíciles de PCR múltiple pueden ser mejoradas significativamente mediante el uso de un aditivo de PCR, tal como DMSO, glicerol, formamida y betaína, que relajan la doble hélice de ADN, haciendo así más fácil la desnaturalización del molde. Varios autores recomiendan DMSO y glicerol para mejorar la eficiencia de amplificación (mayor cantidad de producto) y especificidad (no hay productos inespecíficos) de la PCR, cuando se usa en concentraciones que varían entre 5% - 10% (vol / vol). En la PCR múltiple, la utilidad del DMSO y del glicerol necesita ser probada en cada caso. El BSA, en concentraciones de hasta 0,8 mg / L aumentó la eficiencia de la PCR mucho más que el DMSO o el glicerol. El BSA no tiene efectos inhibitors en los loci amplificados en los experimentos de Henegariu.


text: Las primeras rondas de ciclos térmicos tienen un efecto sustancial en la sensibilidad y la especificidad de la PCR. Suponiendo una desnaturalización eficiente de la diana, el éxito general de la amplificación específica depende de la velocidad a la que los cebadores hibridan con su objetivo y la velocidad a la que los cebadores hibridados se extienden a lo largo de la secuencia deseada durante los ciclos tempranos, medios y finales de la amplificación. Los factores que impiden que las tasas de hibridación sean las óptimas incluyen cebadores mal diseñados, componentes de amortiguación debajo de los niveles óptimos y temperatura de hibridación. La tasa de extensión de los híbridos de los cebadores específicos depende de la actividad de la enzima, la disponibilidad de los componentes esenciales, tales como dNTPs y la naturaleza del ADN diana. Por lo tanto, la mayoría de las modificaciones para mejorar el rendimiento de PCR se han dirigido hacia los factores que afectan las tasas de hibridación y extensión.


text: En las pruebas hechas en 1997 por el equipo de Henegariu, los resultados obtenidos cuando cuatro mezclas de amplificación diferentes que contienen cantidades iguales de diferentes cebadores fueron sometidos a PCR múltiple con el programa A y el programa B; este último programa tenía una temperatura más alta de extensión (72 °C) y a tiempos de hibridación y de extensión más largos. En general, hubo un rendimiento visiblemente más alto de productos de PCR con el programa A. Además, con el programa B, algunos productos se perdieron y algunos productos no específicos sí aparecieron. Los resultados con el programa B se consideraron menos deseables en general y sugirieron que la temperatura de extensión mayor en el programa B disminuyó la amplificación de algunos loci, a pesar de que fue probado para compensar el uso de un tiempo de hibridación más largo y tiempo de extensión ligeramente más largo de lo normal.


text: En la PCR múltiple, a medida que la amplificación simultánea de los loci va aumentando, la cantidad de enzima y de los nucleótidos se convierte en un factor limitante y es necesario más tiempo de extensión para que la polimerasa pueda completar la síntesis de todos los productos. Dos experimentos han ilustrado la influencia de la optimización del tiempo de extensión. En un experimento, se añadió un par de cebadores del cromosoma Y (Y6BaH34pr, 910bp) a una mezcla de cebadores del cromosoma X (X-3). Los resultados mostraron que el aumento del tiempo de extensión en la PCR múltiple (programa A vs. programa D) aumentó la cantidad de productos más largos. En otro experimento, cuatro mezclas múltiples para el cromosoma Y fueron amplificados con rendimientos visiblemente más altos utilizando los programas C y A con tiempos de extensión más altos.


text: Se ha demostrado que la modificación del tiempo de hibridación de 20 s a 2 min no altera la eficiencia de amplificación. La temperatura de hibridación es uno de los parámetros más importantes. Aunque muchos loci individuales podrían ser amplificados específicamente a 56 °C - 60 °C, la reducción de la temperatura de recocido por 4 °C - 6 °C se requiere para el mismo loci para ser co-amplificado en mezclas múltiples. Cuando muchos loci específicos se amplifican simultáneamente, los loci amplificados de manera más eficiente influirán negativamente en el rendimiento del producto de los loci menos eficiente. Esto es debido al hecho de que la PCR tiene un suministro limitado de enzima y nucleótidos, y todos los productos compiten por el mismo grupo de suministros.


text: Los productos de PCR múltiple, que difieren entre sí en un 30 pares de bases a 40 pares de bases de longitud podrían ser convenientemente separados en geles de uso común de agarosa al 3%. Realizar la separación de los productos en gradientes durante la noche disminuye la nitidez de las bandas individuales de PCR, especialmente cuando los productos son más pequeños que 400 pares de bases a 500 pares de bases.


text: Para separar los productos de PCR que difieren en solo unos pocos pares de bases de longitud (por ejemplo, marcadores de microsatélites), se requieren de geles de poliacrilamida (PAA) de entre 6% y 10%. Considerando que los geles de PAA no desnaturalizantes funcionan muy bien para loci no polimórficos, bandas inusuales aparecen cuando los microsatélites se separan en este tipo de gel. Por ejemplo, en un análisis de algunos loci polimórficos del cromosoma 12 a partir de dos hibridomas, se encontraron 2 bandas en el gel de PAA no desnaturalizante.


text: Múltiples técnicas, incluyendo RT-PCR, PCR punto final, PCR en tiempo real, Reacción en Cadena de la Ligasa y la Amplificación Mediada por Transcripción, se han desarrollado para amplificar y detectar genes de una manera similar para ensayos múltiples. Por ejemplo, la fusión de genes específicos observados en los tumores sólidos son marcadores de diagnóstico extremadamente útiles. Un ensayo basado en multiplexación de cebadores y sondas utilizando PCR en tiempo real, que permite la detección (bajo condiciones idénticas de PCR) de las diferentes fusiones, fue utilizado para el diagnóstico genético de rutina de células tumorales. La ventaja de este análisis de fluorescencia múltiple de translocaciones cromosómicas es que este método disminuye la manipulación de productos de PCR y reduce considerablemente el riesgo de contaminación cruzada vinculado al arrastre de los productos de RT-PCR. Además, constituye un paso importante hacia la automatización de la detección de la fusión génica específica del cáncer. La reacción en cadena de la ligasa (LCR) implica ciclos repetitivos de la ligadura de dos pares adyacentes de oligonucleótidos para formar productos ligados durante más tiempo en una técnica dependiente del molde. Se ha reportado que la LCR Múltiple es útil para la determinación simultánea de alelos normales y mutantes causantes de fibrosis quística. Una discriminación de mutaciones se logró utilizando LCR competitivo con seis oligonucleótidos y con una LCR múltiple competitiva usando 12 oligonucleótidos para detectar ambos alelos para dos mutaciones en un solo tubo de PCR. Aunque los equipos que ofrecen diversos grados de automatización se han adaptado a estas técnicas, la automatización completa no está disponible todavía.


text: Este tipo de ensayo implica el uso simultáneo de un par de cebadores universales, un par de cebadores específicos para un control interno (anidado) y un par de cebadores que no son específicos para la especie que se desea investigar. La especificidad de cada cebador debe ser evaluada en silicio, empíricamente, y verificada adicionalmente mediante secuenciación de los productos de amplificación. Por ejemplo, un par de cebadores específicos para ARN ribosomal de la subunidad 18S, cinco cebadores internos (anidados) oligonucleótidos específicos para los genes de la subunidad 18S del ARN ribosomal universales para el par de cebadores iniciales y un cebador específico para la especie en cuestión que no esté anidado.


text: Este método se utilizó para discriminar entre seis larvas de bivalvos comunes en las aguas costeras danesas (Cerastoderma edule, Macoma balthica, Mytilus edulis, Spisula subtruncata, Ensis americanus y miembros de la orden Myoida). Identificación individual de larvas de bivalvos aislados a partir de muestras de plancton se basa en el tamaño del producto de PCR producido por los cebadores específicos después de la visualización por electroforesis en gel de agarosa. Los estudios preliminares indicaron que este método es adecuado para su uso con muestra recién recogida y larvas conservadas y es, por tanto, adecuado para su aplicación en el campo.


text: Una Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple Anidada fue adaptada a un sistema de tiempo real para la detección del virus del herpes simple (tipos 1 y 2) y el virus de varicela zóster, los resultados fueron comparados usando electroforesis en gel de agarosa. Se encontró que es una alternativa conveniente a la PCR convencional. Se mejora el tiempo de respuesta del espécimen mediante la eliminación de la necesidad de la electroforesis en gel, transiluminación y la fotografía del gel. También muestra aumento de la sensibilidad en los ensayos estándar y reduce aún más la posibilidad de contaminación de amplicones con protocolos de PCR anidadas.


text: Este enfoque incluye conjuntos de cebadores anidados dirigidos a conservar las regiones de genes de virus humanos, los cuales se transcriben mediante Transcripción Inversa al mismo tiempo que los controles internos lo hacen de la manera convencional.


text: Como es necesario un diagnóstico rápido, sensible y preciso de infecciones de las vías respiratorias inferiores en los niños, pacientes inmunocomprometidos y ancianos, el ensayo de PCR Múltiple Anidada con Transcripción Inversa se ha utilizado ampliamente para la detección simultánea de los virus no relacionados implicados en enfermedades infecciosas a causa de su alta especificidad y sensibilidad. Comparando sus resultados con cultivos convencionales virales, ensayo de inmunofluorescencia y una RT-PCR Múltiple para todos los tipos de virus de parainfluenza humanos, los ensayos de RT-PCR Múltiple Anidada proporcionan un sistema capaz de detectar e identificar simultáneamente 14 virus respiratorios diferentes en muestras clínicas con alta sensibilidad y especificidad, siendo útiles para el diagnóstico de rutina y el control de estos virus dentro de la población.


text: La PCR Múltiple tiempo real basada en tecnología TaqMan fue desarrollada para identificar el locus ttrRSBCA y el gen invA para la detección precisa de "Salmonella spp". en los productos frescos y los huevos. Con el fin de reforzar la especificidad del ensayo de PCR cuantitativa para "Salmonella", una PCR Múltiple cuantitativa (tiempo real) dirigida específicamente al gen y locus mencionados anteriormente fue evaluada, obteniendo resultados concluyentes sobre su sensibilidad y especificidad.


text: La contaminación de los alimentos, sobre todo los huevos, con Salmonella spp. es una gran preocupación para la salud pública. Por lo tanto, es urgente el desarrollo de un método rápido para la detección de Salmonella en los productos alimenticios importantes. El ensayo de PCR Múltiple Cuantitativa desarrollado en este estudio permite la detección rápida y precisa de Salmonella spp. en seis materias primas de alto riesgo y en huevos y tiene el potencial necesario para ser utilizado con otras matrices alimentarias.


text: La PCR Múltiple Cuantitativa basada en un Arreglo de ADN (MQDA-PCR) es muy general y se puede utilizar en todas las áreas de las ciencias biológicas donde se desea realizar la cuantificación simultánea de múltiples genes objetivos. El método se basa en una PCR de dos etapas. En los primeros ciclos se emplean cebadores bipartitos que contienen una región universal en el extremo 5’ y una región universal específica en el extremo 3’ para cada constructo modificado genéticamente. Los cebadores utilizados son entonces degradados con una exonucleasa de cadena única específica para ADN. El segundo paso de la PCR se ejecuta solo con cebadores que consisten en la región del extremo 5’. La eliminación de los cebadores es esencial para crear una PCR competitiva y, por lo tanto, cuantitativa. Los oligonucleótidos que se hibridan a segmentos internos de los productos de PCR, son entonces marcados en una secuencia específica en una reacción de amplificación lineal con una señal cíclica. Esto se hace tanto para aumentar la sensibilidad como la especificidad del ensayo. La hibridación de los oligonucleótidos marcados a sus secuencias complementarias en una matriz de ADN permite la detección múltiple.


text: Este método fue desarrollado y evaluado por Knut Rudi y su equipo en 2003 para la cuantificación de maíz transgénico en alimentos y piensos. Diecisiete muestras de alimentos y piensos diferentes fueron seleccionados utilizando un sistema múltiple (específicamente de doce) para la detección simultánea de siete tipos diferentes de maíz genéticamente modificados (Bt 176, Bt11, MON810, T25, GA21, CBH351 y DBT418). Diez muestras fueron modificadas genéticamente para tener controles positivos que contiene principalmente mezclas de MON810 y Bt11 ADN Bt176. Un sistema MQDA-PCR de ocho complejos para la detección del maíz MON810, Bt11 y Bt176 fue evaluado haciendo una comparación con un sistema simple de PCR que actúa con una nucleasa que corta en el extremo 5’. Llegaron a la conclusión de que el método descrito es modular, y por lo tanto adecuado para las necesidades futuras en la detección de organismos genéticamente modificados.


text: Un protocolo de PCR Múltiple en tiempo real, utilizando primers específicos de ciertos genes y sondas TaqMan, ofrece genotipificación y cuantificación simultánea de esos genes con una sensibilidad aceptable.


text: Este método fue utilizado por Kottaridi, Spathis, Ntova, Papaevangelou y Karakitsos en 2012 para la detección y cuantificación de los genotipos más comunes de rotavirus humanos debido a que el grupo A de rotavirus (RVs) son patógenos importantes que causan deshidratación y gastroenteritis agudas en lactantes y niños pequeños. Ellos fueron capaces de detectar cepas de rotavirus con las combinaciones de genotipo más común G4P (70,7%), G1P (10,9%), G2P (5,4%) y G9P (2,2%).


text: Ensayos de PCR Múltiple en Tiempo Real con Transcripción Inversa usando sondas TaqMan individuales se desarrollaron y evaluaron con un ensayo de TaqMan RT-PCR tiempo real por Tineke y sus colaboradores en 2009 con un Control de Procesos de Muestras para la Detección de ARN F-específicos de Genogrupos de Colifago I y IV, lo que resulta en la detección exitosa de genogrupo IV con el ensayo multiplexado en el 80% de las muestras fecales. El desarrollo de este método se debe a la creciente preocupación de la transmisión zoonótica de algunos virus entéricos animales, como calicivirus, virus de la hepatitis E y el rotavirus, que están estrechamente relacionados con las cepas patógenas humanas.


text: PCR Múltiple-Ready puede lograr una alta tasa de éxito (92%) para la amplificación de secuencias publicadas bajo condiciones de reacción estándar, con una especificidad comparable a la de los métodos de PCR convencionales. Es compatible con un nivel más elevado de multiplexación en los genomas de plantas de diferentes tamaños y la ploidía, sin la necesidad de optimizar cuidadosamente las condiciones de ensayo. Varias ventajas de la PCR Múltiple-Ready para el genotipado de SNP y SSR incluyen la amplificación uniforme de secuencias diana dentro de las reacciones multiplexadas y entre ensayos independientes, y la capacidad de etiquetar amplicones durante la PCR con restos especializados, tales como los marcadores fluorescentes y la biotina. Este nuevo método de PCR múltiple facilita el genotipificado de SSR basado en la fluorescencia y la preparación multiplexada de moldes de ADN para ensayos de SNP. Estas ventajas pueden ser capturadas en varios puntos en el proceso de determinación del genotipo y ofrecen un considerable ahorro de costos y de trabajo. La PCR Múltiple-Ready es ampliamente aplicable a la genómica de plantas y asistida por marcadores de cría, y debería ser transferible a cualquier especie animal o vegetal, sin embargo esto no ha sido comprobado todavía.


text: Visual OMP


text: El problema más común con el diseño de cebadores es que una alta sensibilidad y especificidad son difíciles de lograr para la PCR debido a ciertos obstáculos como dímeros de cebadores, las hibridaciones inespecíficas y competencia de estructura secundaria. Estas cuestiones solo se magnifican a medida que aumenta de tamaño de la muestra múltiple. Visual OMP (Plataforma de Modelado de Oligonucleótidos + Equilibrio Multiestado) permite al usuario realizar sus experimentos en silico antes de comprar y optimizar sus cebadores y sondas experimentalmente; así como diseñar, simular y analizar la PCR Múltiple, sondas TaqMan, balizas moleculares, microarreglos, ensayos de FRET alelo-específica, RNAi y sondas antisentido; predecir la termodinámica de hibridación, estructura plegable secundaria y simular las curvas de fusión. Visual OMP ha integrado en su sistema buscadores como: ThermoBlast, clustal, BLAST y Entrez.


text: PrimerPlex


text: PrimerPlex es una herramienta eficiente y sofisticada para diseñar oligonucleótidos para ensayos múltiples. Permitiendo la fácil amplificación de múltiples objetivos en un solo recipiente de reacción, reduciendo tanto el tiempo como el costo de la experimentación.


text: El diseño de cebadores para PCR múltiple presenta varios desafíos que incluyen dímeros de cebadores, la incapacidad para separar los amplificados con movilidad electroforética y similares errores de cebado debido a la unión no específica a las plantillas de ADN no objetivo. PrimerPlex utiliza algoritmos propios para diseñar conjuntos óptimos de cebadores múltiples en condiciones de reacción uniformes para 40 secuencias. Los conjuntos de cebadores se identifican después de examinar a todos los cebadores en un pool y minimizar los desajustes de las temperaturas de fusión (Tm) para asegurar la amplificación específica y la alta fluorescencia de la señal. En este proceso, se analizan millones de posibles conjuntos de cebadores múltiples en pocos segundos y se presenta una lista de conjuntos alternativos. Con este software se pueden especificar las diferencias de tamaño mínimo del producto entre el conjunto de pares de cebadores diseñados para una mejor visualización de las bandas en un gel. Para asegurar la especificidad del cebador, pueden ser buscados desde PrimerPlex BLAST contra cualquiera de las bases de datos genómicas disponibles en NCBI.